El diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Chlamydia trachomatis.

Tracto ocular y genital

Para las muestras oculares y del tracto genital, el laboratorio suele recibir hisopos en un medio de transporte con antibióticos. Las muestras que se analizarán mediante EIA, DFA, NAH o NAA comerciales deben manipularse según lo especificado en el prospecto. Los protocolos de prueba caseros deben validarse según su rendimiento y consenso, según las directrices de las agencias de acreditación.

Pus de bubón

Para preparar el pus del bubón, el material viscoso se muele y se suspende en caldo nutritivo o medio de cultivo celular hasta alcanzar al menos el 20 % de su peso. Incluso si el pus no es viscoso, se recomienda diluirlo. Si el pubón no presenta fluctuaciones, se puede inyectar y aspirar solución salina estéril para intentar aislarlo. El material debe analizarse para detectar contaminantes bacterianos sembrando en agar apropiado y luego inocularse en cultivos celulares para aislar clamidias.

Hisopos nasofaríngeos

El hisopo nasofaríngeo se coloca en un medio de cultivo celular y se emulsiona completamente mediante agitación con perlas de vidrio en un recipiente estéril herméticamente cerrado. Los extractos deben centrifugarse de 20 a 30 minutos a 100 g para eliminar el material grueso antes de inocular el sobrenadante en las monocapas celulares.

Hisopos rectales

Los hisopos rectales se suspenden en un medio de cultivo celular que contiene gentamicina y vancomicina. La suspensión se agita vigorosamente y se centrifuga a 300 g durante 10 min, utilizándose el sobrenadante. Este puede diluirse aún más (1:2 y 1:20) con medio de cultivo antes de inocularse en el cultivo celular. Los hisopos de pacientes con sexo anal también pueden ser útiles para la prueba de NAA, especialmente para la identificación de los serotipos L causantes del LGV.

Muestras de tejido

El tejido congelado se descongela, se pica con tijeras esterilizadas y se muele con un mortero o un homogeneizador. Se añade el volumen de medio de cultivo celular necesario para preparar una suspensión del 10 % al 20 %, y esta se mezcla bien. En el caso de las muestras de tejido, a menudo se requieren diluciones seriadas (1:10 a 1:100) para la inoculación y así contrarrestar la toxicidad.

Semen

Los posibles donantes de semen pueden donar un FVU para la prueba de NAA. El semen (almacenado congelado) debe analizarse con una prueba de NAA validada para este fin.

Examen citológico directo

Las infecciones de la conjuntiva se pueden diagnosticar mediante la detección de inclusiones intracitoplasmáticas típicas. Para la tinción de Giemsa, el frotis se seca al aire, se fija con metanol absoluto durante al menos 5 minutos y se seca de nuevo. Luego se cubre con la tinción de Giemsa diluida recién preparada durante al menos 1 hora. El portaobjetos se enjuaga rápidamente en etanol al 95% para eliminar el exceso de colorante y luego se seca y se examina al microscopio. Las inclusiones son basófilas y se tiñen de un azul rosado. Las pruebas citológicas para detectar inclusiones son particularmente útiles en el diagnóstico de la conjuntivitis aguda por inclusiones del recién nacido; la sensibilidad de este método supera el 90%. Las pruebas citológicas son relativamente insensibles para diagnosticar infecciones conjuntivales y del tracto genital en adultos.

Aislamiento en cultivo celular

El cultivo es el único procedimiento que confirma la presencia de organismos viables. Puede haber antígenos, ácidos nucleicos o anticuerpos en ausencia de partículas infecciosas viables.

La mayoría, si no todas, las clamidias parecen ser capaces de crecer en cultivos celulares si el inóculo se centrifuga sobre monocapas celulares preformadas y pretratadas ( 12 ). Antes de la inoculación y centrifugación, las monocapas celulares preformadas se pueden tratar con 30 µg/mL de dietilaminoetil-dextrano en solución salina equilibrada de Hanks durante 20 min para cambiar la carga negativa en la superficie celular y facilitar la adhesión de las clamidias a la monocapa celular. Esto no es necesario para los serovares de LGV, pero facilita las infecciones por otros serovares. Las cepas de LGV son capaces de crecer en serie en cultivos celulares sin centrifugación. Las células McCoy, HEp-2 y HeLa se utilizan con mayor frecuencia para C trachomatis . Las muestras clínicas se deben inocular en cultivos de monocapa tratados con cicloheximida de células McCoy u otras células apropiadas. La inoculación implica la centrifugación de la muestra sobre la monocapa celular, seguida de una incubación de 48 a 72 h y la tinción para detectar inclusiones intracitoplasmáticas. Para el método de viales de concha, las células McCoy se siembran en cubreobjetos de vidrio de 12 mm en viales desechables de 15 mm de diámetro y 3,697 mL. La concentración celular (aproximadamente de 1 x 10⁻¹ ^células /mL a 2 x 10⁻¹ ^células /mL) se selecciona para obtener una monocapa ligera y confluente tras una incubación de 24 a 48 h a 35 °C a 37 °C en CO₂ al 5 % _. Para obtener resultados óptimos, las células deben utilizarse en las 24 h siguientes a la confluencia.

Las muestras clínicas se agitan con microesferas de vidrio estériles de 5 mm para lisar las células epiteliales y liberar las clamidias antes de su inoculación. Este procedimiento es más seguro y práctico que la sonicación. Para la inoculación, se retira el medio de la monocapa celular y se añaden de 0,1 mL a 1 mL de inóculo a las células. La muestra se centrifuga sobre la monocapa celular a aproximadamente 3000 g a temperatura ambiente durante 1 h. Si se pretende o se prevé la realización de pases, las muestras se inoculan por duplicado. Los viales Shell se incuban a 35 °C en CO₂ al 5 % _durante 2 h para permitir la absorción de las clamidias. A continuación, se desecha el medio y se sustituye por medio que contiene 1 µg de cicloheximida/mL. Las células se incuban a 35 °C en CO ₂ al 5 % durante 48 a 72 h, y se examina un cubreobjetos para detectar inclusiones mediante inmunofluorescencia, tinción con yodo o tinción de Giemsa. Aunque se requiere un microscopio de fluorescencia, la inmunofluorescencia es el método preferido porque es más específico que la tinción con yodo o Giemsa y puede dar un resultado positivo tan pronto como 24 h después de la inoculación. Para el tracoma, la conjuntivitis por inclusión y las infecciones del tracto genital, el cultivo se realiza como se describió anteriormente. Para el LGV, el pus del bubón aspirado o el hisopo rectal deben diluirse (1:10 y 1:100) con medio de cultivo celular antes de la inoculación. Siempre se deben realizar segundos pases porque los detritos del inóculo pueden dificultar la lectura de los portaobjetos.

Detección de antígenos

Hay varios EIA comerciales disponibles para la detección de antígenos de clamidia en muestras clínicas ( 13 ). Estos productos utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales para detectar el lipopolisacárido (LPS) de clamidia, que es más soluble que la proteína principal de la membrana externa (MOMP). La mayoría de los EIA tardan varias horas en realizarse y son adecuados para el procesamiento por lotes. Los perfiles de sensibilidad de los EIA de C trachomatis disponibles comercialmente varían del 65% al ​​75% en comparación con los ensayos NAA. Sin confirmación, las pruebas tienen una especificidad del 97%. Por lo tanto, no son susceptibles de detección en poblaciones de baja prevalencia debido al bajo valor predictivo de un resultado positivo en dichos grupos. Para abordar este problema, se han desarrollado pruebas confirmatorias en las que todas las pruebas que dan resultados positivos se repiten en presencia de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el epítopo específico del grupo en el LPS. Esto bloquea las reacciones específicas, pero no las reacciones falsamente positivas ( 14 ). La aplicación adecuada de pruebas confirmatorias aumenta la especificidad a aproximadamente el 99,5 %. Otro enfoque de confirmación consiste en analizar la muestra con una segunda prueba basada en un principio diferente (p. ej., una prueba DFA basada en la detección de MOMP para confirmar un EIA basado en LPS).

Las pruebas diagnósticas que involucran anticuerpos monoclonales se basan en la detección de cuerpos elementales (CE) en frotis ( 15 ). La prueba DFA tiene aproximadamente 75% a 85% de sensibilidad y 98% a 99% de especificidad en comparación con el cultivo, y menor sensibilidad (aproximadamente 70%) en comparación con las pruebas NAA. Varios ensayos DFA están disponibles comercialmente y utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra MOMP (Syva Microtrak, EE. UU.; Trinity Biotech, Irlanda) o LPS (Kallestad, EE. UU.). Los anticuerpos monoclonales para LPS tiñen todas las clamidias, pero la muestra puede ser más difícil de leer debido a la distribución desigual de LPS en la partícula de clamidia. Los anticuerpos monoclonales anti-MOMP se preparan contra C trachomatis ; por lo tanto, son específicos de la especie. La calidad de la fluorescencia es mejor porque MOMP se distribuye uniformemente en la partícula de clamidia. Este procedimiento ofrece un diagnóstico rápido, tomando solo 30 minutos para realizar. Una variante del procedimiento DFA consiste en centrifugar el medio de transporte utilizado para otras pruebas (cultivo celular, NAA o EIA), preparar un portaobjetos con el sedimento y teñirlo con reactivos de anticuerpos fluorescentes. Esto se suele utilizar como prueba confirmatoria de resultados positivos en otras pruebas. El DFA requiere la experiencia de un microscopista experimentado y, actualmente, no es automatizable. Por lo tanto, no es adecuado para laboratorios con un volumen de trabajo muy alto.

Se han desarrollado varias pruebas comerciales de EIA en el punto de atención y han mostrado rasgos de rendimiento variables. Estas pruebas generalmente se realizan en 30 minutos y facilitan el tratamiento inmediato de los pacientes infectados. Las pruebas en el punto de atención disponibles actualmente tienen una sensibilidad del 60% al 70% en comparación con las pruebas NAA, y la especificidad también puede ser inferior al 100%. Estas pruebas no son económicas y no están diseñadas para usarse en entornos de laboratorio. Si se puede mejorar su rendimiento y reducir sus costos, las pruebas comerciales de EIA en el punto de atención ofrecerían la capacidad de evaluar poblaciones de difícil acceso y que casi inevitablemente no regresan para la atención de seguimiento; esto permitiría el tratamiento de más casos ( 16 ).

No

Las pruebas de NAH disponibles comercialmente para C trachomatis en algunas partes del mundo se han utilizado tan ampliamente como los EIA en laboratorios que manejan grandes cantidades de muestras diariamente. Una prueba de sonda disponible comercialmente (PACE 2, Gen-Probe Inc, EE. UU.) utiliza la hibridación de ADN-ARN en un esfuerzo por aumentar la sensibilidad mediante la detección de ARN clamidial. Los datos disponibles sugieren que esta prueba de sonda es relativamente específica y proporciona una sensibilidad similar a la de los mejores métodos de detección de antígenos y cultivo celular ( 17 ). Otra prueba de NAH, la Hybrid Capture II para C trachomatis (Digene Corporation, EE. UU.) utiliza un componente de amplificación de señal para aumentar la sensibilidad a aproximadamente el 90% de los ensayos de NAA ( 18 ).

NAA

Varios métodos de NAA están actualmente autorizados en Canadá para la detección de C. trachomatis en muestras clínicas: reacción en cadena de la polimerasa [PCR] Amplicor (Roche Molecular Systems, EE. UU.), ensayo de reacción en cadena de la ligasa LCx (Abbott Laboratories, EE. UU.), amplificación mediada por transcripción AMP-CT y APTIMA Combo 2 (Gen-Probe Inc, EE. UU.) y amplificación por desplazamiento de cadena ProbeTec (BD Diagnostic Systems, EE. UU.). Solo las muestras aprobadas, como se describe en cada prospecto, deben analizarse en estos ensayos. Los ensayos de PCR, reacción en cadena de la ligasa y amplificación por desplazamiento de cadena amplifican secuencias de nucleótidos del plásmido críptico, que está presente en múltiples copias en cada EB de C. trachomatis . La reacción de amplificación mediada por transcripción se dirige contra el ARN ribosómico, que también está presente en múltiples copias. En teoría, dada la multiplicidad de sitios objetivo para los procedimientos de amplificación que se utilizan, estas técnicas deberían poder detectar menos de un EB, y pueden hacerlo en suspensiones purificadas de partículas de clamidia. Sin embargo, la sensibilidad real con muestras clínicas es menor (90% a 96%) debido a la variabilidad del muestreo y la inhibición de las reacciones de amplificación por factores en las muestras ( 19 ). Todos los ensayos parecen ser altamente específicos si se evitan los problemas con la contaminación cruzada de las reacciones. Las evaluaciones clínicas de estos métodos de amplificación han demostrado una mayor sensibilidad que el cultivo y los otros métodos sin cultivo (microscopía, inmunoensayos y ensayos NAH) ( 20 , 21 ). Los ensayos NAA que se utilizan actualmente tienen un bajo rendimiento de muestras, pero los laboratorios pueden utilizar procedimientos rentables de FVU o agrupación de muestras de hisopo mientras mantienen la precisión de la prueba ( 22 ). Los ensayos NAA se han convertido en las pruebas de elección para el diagnóstico de la infección por C trachomatis en los laboratorios clínicos de rutina. Aunque las pruebas comerciales de NAA no han sido aprobadas para muestras rectales, la mayoría detectará todos los serovares de C trachomatis , incluyendo las cepas L 1-3 (LGV). La identificación de estas cepas requiere pruebas confirmatorias con polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o técnicas de secuenciación porque los regímenes de tratamiento son diferentes. En 2002 23 ), los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos recomendaron que todos los resultados positivos de la prueba de NAA se repitieran en la misma prueba o en un ensayo de NAA diferente. Repetir las pruebas de muestras cerca del punto de corte de un ensayo también puede aclarar si es positivo o negativo. Debido a que estas maniobras son costosas, requieren mucho tiempo y validación, los autores no recomiendan en este momento la adopción de estas maniobras de forma rutinaria.

Varios fabricantes suministran actualmente sistemas basados ​​en ácidos nucleicos diseñados para detectar tanto C. trachomatis como Neisseria gonorrhoeae en el mismo ensayo con una sola muestra. Esto refuerza el valor del laboratorio en el manejo de pacientes, ya que se ha demostrado que un número significativo de pacientes infectados con C. trachomatis presentan infección simultánea por N. gonorrhoeae . La mejora de la automatización parcial ha permitido que estos sistemas admitan un procesamiento de varios cientos de muestras al día.

Serología

No se recomienda la serología para diagnosticar infecciones por clamidia, con la excepción de la infección en neonatos, pacientes con infertilidad por factor tubárico y ocasionalmente para infecciones por LGV cuando no se dispone de aspirados de bubón. A menudo, la serología no está disponible, excepto en laboratorios de referencia como el Laboratorio Nacional de Microbiología (Winnipeg, Manitoba). La prueba clásica de fijación del complemento rara vez se realiza hoy en día. La prueba de microinmunofluorescencia, desarrollada por Wang y Grayston ( 24 ), es el método actual de elección para el serodiagnóstico de la infección por clamidia. La prueba de microinmunofluorescencia es útil para diagnosticar la infección por clamidia en neonatos. Los niveles altos de anticuerpos IgM se asocian regularmente con la enfermedad. Los anticuerpos IgG son menos útiles porque los bebés se presentan clínicamente cuando aún tienen un nivel alto de IgG materna. Debido a que se requieren de seis a nueve meses para que desaparezcan los anticuerpos maternos anticlamidias, se puede realizar la prueba de IgG a los bebés mayores de nueve meses. Los lactantes con conjuntivitis de inclusión o portadores de clamidias en las vías respiratorias sin neumonía suelen presentar niveles muy bajos de anticuerpos IgM. Por lo tanto, un solo título de IgM de 32 o superior puede respaldar el diagnóstico de neumonía por clamidias en estos casos.

Otros ensayos incluyen la prueba de inmunofluorescencia de inclusión completa, el EIA con EB, cuerpos reticulados o células infectadas y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas recombinante para LPS. Otras pruebas serológicas incluyen la hemaglutinación indirecta, la neutralización, la precipitación, la difusión en gel, la fluorescencia ligada a enzimas, la inmunoperoxidasa y la inmunoelectroforesis. La mayoría de estos ensayos emplean métodos propios, aunque algunos se han comercializado y se utilizan en laboratorios clínicos. La determinación de anticuerpos totales mediante fijación del complemento o inmunofluorescencia de inclusión completa ha sido útil para identificar pacientes con infertilidad por factor tubárico ( 25 , 26 ).