Abstracto
Resumen simple
La anaplasmosis es una enfermedad emergente transmitida por garrapatas, ampliamente extendida, generalmente transmitida por la especie de garrapata Ixodes . Dos miembros del género Anaplasma, A. phagocytophilum (que infecta a los neutrófilos) y A. platys (que infecta a las plaquetas), causan anaplasmosis granulocítica y trombocitopenia en algunos animales y humanos. Nuestro informe de caso describe la anaplasmosis granulocítica en dos perros analizados rutinariamente para la donación de sangre. El frotis de sangre fue negativo para patógenos transmitidos por garrapatas y los hallazgos hematológicos indicaron trombocitopenia en ambos perros. Los perros fueron levemente positivos en las pruebas ELISA para la detección de anticuerpos para Anaplasma spp. El resultado de qRT-PCR fue negativo para A. platys pero positivo para A. phagocytophilum . En conclusión, la prueba molecular es obligatoria para la confirmación de la infección por Anaplasma spp. y sugerimos que se implemente en todos los donantes de sangre.
Abstracto
Este estudio describe la anaplasmosis granulocítica en dos perros infectados naturalmente con Anaplasma phagocytophilum . Los perros de 3 años (macho y hembra) provenían del mismo hogar y fueron remitidos a la Facultad de Medicina Veterinaria en Iasi para donación de sangre. Fueron sometidos a pruebas rutinarias estándar: análisis de sangre hematológico, frotis de sangre y pruebas serológicas (VETSCAN ® FLEX4 e IDEXX SNAP 4Dx Plus). La perra no tuvo problemas médicos, mientras que el perro macho experimentó dolor en las articulaciones. El frotis de sangre fue negativo para patógenos transmitidos por garrapatas, y los hallazgos hematológicos indicaron trombocitopenia en ambos perros, y el perro macho también mostró eosinofilia. Los dos perros fueron levemente positivos en las pruebas ELISA para la detección de anticuerpos de Anaplasma spp.; por lo tanto, las muestras de sangre se analizaron utilizando el método qRT-PCR para Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum . El resultado de la qRT-PCR fue negativo para A. platys , pero positivo para A. phagocytophilum . El tratamiento consistió en la administración de doxiciclina durante 28 días. En conclusión, el elevado número de casos con signos clínicos inespecíficos, la diferente sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas inmunocromatográficas, así como la posibilidad de confundir la mórula durante el examen citológico, hacen imprescindible la prueba molecular para un diagnóstico preciso.
Palabras clave: Anaplasma phagocytophilum , perros, qRT-PCR, IDEXX, FLEX4, donación de sangre
1. Introducción
El género Anaplasma incluye bacterias Gram-negativas de gran importancia tanto para la salud veterinaria como para la humana. La anaplasmosis es una enfermedad emergente transmitida por garrapatas, ampliamente extendida, generalmente transmitida por especies de garrapatas Ixodes , aunque también se han reportado otras formas de transmisión de la infección [ 1 , 2 ]. Los agentes transmitidos por garrapatas pueden propagarse verticalmente en mamíferos durante la gestación, el parto o en la etapa posparto. Las transfusiones de sangre son otro medio de transmisión, por lo que es importante analizar los productos sanguíneos caninos en áreas altamente endémicas [ 3 , 4 , 5 ]. Los huéspedes móviles y las garrapatas infectadas en mamíferos o aves migratorias pueden propagar varios patógenos transmitidos por garrapatas. Por lo tanto, A. phagocytophilum puede sobrevivir entre picos de actividad de garrapatas [ 6 ].
La detección de infecciones transmitidas por vectores en perros es muy importante no solo para los veterinarios, sino también para la salud pública y el control de vectores [ 7 ]. Los grupos profesionales de riesgo, como veterinarios, cazadores y trabajadores agrícolas, así como los residentes de áreas endémicas, están más predispuestos a las picaduras de garrapatas; por lo tanto, se ha observado un aumento en el número de casos de anaplasmosis humana en estas categorías [ 8 , 9 ]. Estas categorías profesionales están más expuestas a las picaduras de garrapatas porque están en contacto directo con mascotas o animales salvajes, además de estar ubicadas en áreas con una alta prevalencia de garrapatas.
Dos miembros de este género, Anaplasma phagocytophilum (que infecta a los neutrófilos) y Anaplasma platys (que infecta a las plaquetas), causan anaplasmosis granulocítica (canina y humana) y trombocitopenia cíclica canina, respectivamente [ 2 , 10 ].
En un metaanálisis mundial sobre la prevalencia de A. phagocytophilum en varias especies animales y de aves, la prevalencia identificada en Europa fue del 19,91%, con una prevalencia más alta de anaplasmosis reportada en animales salvajes (17,64%), en comparación con animales domésticos (10,68%) [ 11 ]. Además, se ha reportado una prevalencia de anaplasmosis granulocítica del 0,5 al 6,3% en perros [ 12 ]. En Europa, la seroprevalencia de anaplasmosis humana se ha reportado moderadamente en comparación con otras áreas del mundo [ 8 ]. La prevalencia de A. phagocytophilum detectada en garrapatas recolectadas de humanos en Rumania fue baja (5,5%) [ 13 ]. Incluso si esta prevalencia es baja, el riesgo en Rumania es generalmente moderado debido a varios factores (por ejemplo, migración animal, calentamiento global, etc.).
En Rumania, se han llevado a cabo varios estudios sobre la infección bacteriana con Anaplasma phagocytophilum en animales, la mayoría de ellos estudios serológicos [ 14 , 15 ], seguidos de estudios moleculares [ 12 , 16 , 17 ]. En consecuencia, se probaron varias especies animales, como perros [ 18 ], ganado [ 19 , 20 ], aves silvestres [ 21 ], zorros rojos [ 22 ], pequeños mamíferos [ 23 ] y jabalíes [ 17 ]. Con respecto a los agentes de anaplasmosis granulocítica, las aves silvestres tienen una competencia de reservorio menor; además, los zorros son un buen modelo de especie centinela que puede ser indicativa del riesgo que representan para la salud pública. Además, los pequeños mamíferos sirven como reservorios importantes para una serie de agentes patógenos y también pueden actuar como reservorios para Anaplasma phagocytophilum , lo que indica su papel potencial en la epidemiología de la anaplasmosis [ 21 , 22 , 23 ].
Debido al largo período de formación de anticuerpos y las múltiples reacciones cruzadas, los métodos de diagnóstico óptimos se consideran pruebas moleculares [ 24 ]. Después de una infección activa o contacto con patógenos, los anticuerpos pueden determinarse entre 7 meses y varios años [ 25 ]. Un resultado falso positivo que ocurre como consecuencia de una reacción cruzada después de una exposición previa a otra especie de Anaplasma sp. o Rickettsia es la principal desventaja de las pruebas rápidas de detección serológica multiplex. Por lo tanto, se recomienda confirmar el diagnóstico utilizando otro método. Las pruebas de PCR en sangre periférica pueden ser un método de diagnóstico más sensible en perros infectados que la serología debido a la naturaleza aguda de la anaplasmosis granulocítica. Los animales asintomáticos infectados con especies de Ehrlichia , Rickettsia o Anaplasma pueden servir como reservorios naturales [ 1 , 26 , 27 ].
El objetivo del estudio fue presentar estrategias diagnósticas para la anaplasmosis granulocítica canina, una enfermedad con síntomas inespecíficos o de evolución asintomática en la mayoría de los casos. Las pruebas moleculares se consideran el método de referencia para el diagnóstico de enfermedades transmitidas por vectores, principalmente en individuos sin signos clínicos.
2. Resultados
Las observaciones microscópicas de los frotis de sangre completa (entre 3 y 5 frotis por cada muestra) fueron negativas para patógenos transmitidos por garrapatas, incluyendo Babesia spp., Anaplasma spp. y Ehrlichia spp. Los resultados del hemograma completo indicaron trombocitopenia en ambos perros: macho: plaquetas: 54 × 10⁻¹ / L; hembra: 12 × 10⁻¹ / L (valores de referencia: 165–500 × 10⁻¹ / L); el macho también presentó eosinofilia (2,36 × 10⁻¹ / L, valores de referencia: 0–0,8 × 10⁻¹ / L).
Tras la ecografía abdominal, se detectó esplenomegalia en ambos pacientes. El bazo presentaba un aspecto homogéneo con ecogenicidad específica, márgenes regulares y vascularidad normal ( Figura 1 ).
Figura 1.
Esplenomegalia; flecha roja: bazo homogéneo.
Los dos perros fueron levemente positivos en las pruebas VETSCAN ® FLEX4 e IDEXX SNAP 4Dx Plus para la detección de anticuerpos de Anaplasma platys / Anaplasma phagocytophilum , por lo que las muestras de sangre se analizaron más a fondo utilizando el método Multiplex qRT-PCR para la detección de A. platys y A. phagocytophilum . Se obtuvo una curva de amplificación específica en ambas muestras solo para A. phagocytophilum ( Figura 2 ). El valor Ct obtenido para la perra (sin signos clínicos) fue de 19,35, lo que sugiere una etapa aguda de la infección, lo que fue opuesto al perro macho (con dolor articular), donde el valor Ct fue de 38,41, lo que podría sugerir una etapa leve o crónica de la infección.
Figura 2.
Curvas de amplificación de muestras de sangre para A. platys y A. phagocytophilum (flecha verde: curva de amplificación para A. phagocytophilum en la perra (Ct = 19,35); flecha amarilla: curva de amplificación para A. phagocytophilum en el perro macho (Ct = 38,41); RFU: unidades de fluorescencia relativas).
El tratamiento consistió en la administración oral de doxiciclina, en dosis de 10 mg/kg al día, durante 28 días. Se prescribió afoxolaner spot-on y milbemicina oxima para prevenir la infestación por garrapatas.
Después de 30 días, los perros fueron llevados a una visita de control. El propietario no observó más signos clínicos. Por lo tanto, se les realizó un examen general y un hemograma completo, pero no se detectaron anomalías.
3. Discusión
Según el conocimiento de los autores, este es el primer estudio en el noreste de Rumania en el que se utilizó el método qRT-PCR para el diagnóstico de la anaplasmosis granulocítica canina, además de los métodos habituales (frotis de sangre y ensayo serológico).
En comparación con los frotis de sangre o los análisis serológicos, la qRT-PCR es más sensible. Dado que aún no se han producido anticuerpos detectables, las pruebas serológicas no son muy útiles en la fase aguda temprana de la infección [ 28 ].
Los perros se consideran especies centinela debido a la similitud entre las cepas de A. phagocytophilum humanas y caninas y debido a la estrecha relación entre humanos y perros. Los perros también pueden infestar hogares con garrapatas infectadas, aumentando la incidencia de enfermedades humanas [ 12 ]. La anaplasmosis granulocítica humana suele ser estacional y la mayoría de los casos se observan durante el período de alta actividad de las garrapatas. La inmunodepresión, la transfusión de sangre y las actividades al aire libre son factores de riesgo importantes para desarrollar una infección por A. phagocytophilum [ 2 ]. Se debe considerar la detección de anaplasmosis humana después de la aparición de anaplasmosis animal en una región determinada [ 29 ].
El diagnóstico de anaplasmosis puede ser un desafío, particularmente durante la etapa aguda. La identificación de A. phagocytophilum no es infrecuente, teniendo en cuenta que el vector principal es Ixodes ricinus , una de las especies de garrapatas más extendidas en Europa [ 10 , 30 ] y también en Rumania [ 13 , 31 , 32 , 33 ]. El análisis citológico del frotis de sangre es un método de diagnóstico económico y rápido [ 29 ], pero el número limitado de células circulantes que pueden analizarse eficazmente mediante microscopía, la falta de células infectadas y la aparición de artefactos intracelulares que pueden imitar las mórulas dificultan el análisis del frotis de sangre [ 28 ]. Según la literatura, las mórulas en los neutrófilos se identifican solo en el 7-32% de los casos de infección natural [ 26 ], lo que explica el hecho de que el frotis de sangre fuera negativo. Además, las mórulas de Anaplasma phagocytophilum son muy similares a las mórulas de E. ewingii [ 26 , 34 ], lo que requiere un método de diagnóstico adicional además del frotis de sangre.
Los dos signos clínicos más significativos y frecuentes de las enfermedades transmitidas por garrapatas caninas parecen incluir trombocitopenia y poliartritis, que pueden revelarse en otras enfermedades [ 35 ]. La poliartritis (inflamaciones articulares, rigidez articular o cojera) se informa con frecuencia en infecciones con A. phagocytophilum , E. canis , E. ewingii o B. burgdorferi [ 26 , 36 ]. En Europa, se detectó cojera en 2 de 18 pacientes caninos con anaplasmosis granulocítica [ 37 ]. Consideramos que la información en la historia clínica sobre el origen de la poliartritis, en conjunto con la infestación previa con garrapatas, ayuda al clínico a determinar si el problema es estrictamente ortopédico o si debe incluir la enfermedad transmitida por garrapatas en la lista de diagnóstico diferencial.
El hallazgo de laboratorio más frecuente en la infección por A. phagocytophilum es la trombocitopenia [ 1 , 34 , 38 , 39 ]. La trombocitopenia es causada por procesos inflamatorios y mediados por el sistema inmunitario, que son consecuencias de las plaquetas secuestradas en el bazo y destruidas por el sistema inmunitario [ 26 ]. Además, se informó ocasionalmente de eosinofilia en perros con anaplasmosis granulocítica [ 38 , 40 ], que también es uno de los resultados de nuestro estudio.
La esplenomegalia es un hallazgo frecuente en la anaplasmosis granulocítica, que se detecta mediante imágenes diagnósticas (radiografía abdominal o ecografía) [ 3 , 26 , 40 , 41 , 42 ]. En infecciones naturales con A. phagocytophilum , se observó esplenomegalia en el 12-100 % de los perros [ 1 ], según nuestra observación. La evaluación ecográfica del tamaño del bazo es subjetiva. En los perros, los márgenes del bazo son redondos y el órgano se extiende caudalmente hacia el lado derecho del abdomen [ 43 , 44 ]. La esplenomegalia con ecogenicidad normal se encuentra secundaria a hematopoyesis extramedular (incluyendo infecciones por Babesia spp. y Anaplasma spp. y anemia inmunomediada), enfermedades infecciosas, infiltraciones malignas (linfoma, tumores de mastocitos), torsión esplénica, congestión, etc. [ 43 , 44 ].
La seroprevalencia se ha utilizado a lo largo del tiempo para obtener una visión general de las enfermedades transmitidas por vectores caninos [ 45 ]. Además, este es un método rápido y económico, utilizado especialmente en clínicas veterinarias privadas. En primer lugar, las muestras de sangre se analizaron con VETSCAN ® FLEX4 (sensibilidad del 93,3 %; especificidad del 96,4 %; según lo especificado por el fabricante), pero según Liu et al. en 2018 [ 7 ], los grados de sensibilidad de VETSCAN ® FLEX4 y la prueba SNAP 4DX Plus fueron del 12,7 % frente al 84,5 %, por lo que decidimos analizar también las muestras de sangre con la segunda prueba serológica. Esto se realizó de acuerdo con un estudio serológico publicado en 2018, donde 11 de 1253 muestras de sangre analizadas para donación fueron positivas para A. platys / A. phagocytophilum , utilizando la prueba SNAP 4DX Plus [ 46 ]. Sin embargo, los resultados de ambas pruebas fueron levemente positivos, por lo que analizamos las muestras para confirmarlo mediante qRT-PCR.
Las opciones moleculares son muy amplias y específicas; por lo tanto, decidimos realizar una qRT-PCR, que se consideró un método de diagnóstico más sensible, porque las pruebas serológicas podrían dar reactividad cruzada con otras bacterias rickettsias [ 26 ]. En nuestra opinión, en el caso de la perra, considerando los resultados en la qRT-PCR, el valor umbral (Ct) indica anaplasmosis granulocítica aguda. Otros autores observaron una alta sensibilidad de las pruebas moleculares, y los resultados positivos aparecieron aproximadamente de seis a ocho días antes de la identificación de mórulas en el frotis de sangre citológico, lo que también ha sido confirmado por nuestro resultado negativo en el examen del frotis de sangre [ 1 ]. Además, las mórulas de Anaplasma spp. pueden desarrollarse durante 4-8 días después de la inoculación en perros infectados experimentalmente [ 37 ]. Nuevas estrategias moleculares, como la qRT-PCR para el diagnóstico de patógenos transmitidos por vectores, permiten la detección temprana y el tratamiento adecuado, reduciendo así las consecuencias de las infecciones con otras enfermedades transmitidas por garrapatas. Además, se han desarrollado múltiples técnicas de diagnóstico molecular en tiempo real dirigidas a genes para la detección de patógenos transmitidos por vectores en sangre, tejidos y vectores [ 29 ].
El tratamiento con doxiciclina se ha implementado con éxito en varios estudios en perros y humanos con infección natural por A. phagocytophilum en Europa y los EE. UU. [ 1 , 8 , 47 , 48 , 49 ].
Los veterinarios están identificando progresivamente perros con coinfecciones de enfermedades transmitidas por vectores. El sistema inmunitario de los pacientes expuestos a garrapatas (sin síntomas aparentes) puede verse afectado por el estrés, el embarazo o la medicación inmunosupresora, lo que puede provocar la aparición o incluso agravar los síntomas de las enfermedades transmitidas por garrapatas. Consideramos que el cribado molecular de enfermedades transmitidas por vectores debe realizarse tanto en perros sospechosos como en perros sanos, especialmente en donantes de sangre.
4. Materiales y métodos
4.1. Presentación clínica
Dos perros de 3 años, un macho y una hembra, del mismo hogar, fueron remitidos a la Facultad de Veterinaria de Iasi para donación de sangre. Los historiales médicos de ambos perros indicaban que ambos habían recibido todas sus vacunas y que ninguno había recibido tratamiento con ectoparasiticidas en los seis meses anteriores.
El examen clínico no reveló problemas médicos en la perra, mientras que el perro macho experimentó dolor articular de etiología desconocida detectado en todas las extremidades.
4.2. Diagnóstico
Además del examen clínico general, el protocolo estándar para la donación de sangre también incluye análisis de sangre para detectar patógenos transmitidos por vectores (análisis hematológico, frotis sanguíneo y pruebas serológicas). Se recogieron muestras de sangre venosa de la vena cefálica en tubos con EDTA y tubos sin anticoagulantes. Para la detección de piroplasmas de Babesia , se tiñeron frotis sanguíneos finos con el kit Diff-Quick (Merck, Millipore Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y se examinaron con un microscopio óptico a ×1000.
Se realizó un hemograma completo (CSC) utilizando un analizador VetScan HM5 (Abaxis, Zoetis, Parsippany, NJ, EE. UU.). Además, para la detección de anticuerpos contra Anaplasma platys / Anaplasma phagocytophilum , Ehrlichia spp. y B. burgdorferi y la identificación del antígeno de D. immitis , se utilizaron dos pruebas: VETSCAN ® FLEX4 (Zoetis, Parsippany, MO, EE. UU.) e IDEXX SNAP 4Dx Plus (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME, EE. UU.) [ 50 , 51 , 52 ]. Además, se realizó una ecografía (Acuson NX3 Elite, Siemens, Berlín, Alemania) para evaluar los órganos abdominales.
El cribado molecular comenzó con la extracción de ADN utilizando BioMagPure 12 Plus (Biosan, Riga, Letonia). El ADN genómico se extrajo de 200 µL de sangre completa utilizando el Blood DNA Extraction Kit 200, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores específicos y la mezcla de sondas para A. platys y A. phagocytophilum se dirigieron a los genes 16S rDNA y msp2, respectivamente, utilizando el principio TaqMan para la detección [ 53 , 54 ]. Por lo tanto, para la detección de A. platys, los cebadores específicos fueron EP-963F y EP-1029R, así como una sonda EP16Sp [ 53 ], y para la detección de A. phagocytophilum, la reacción se realizó utilizando los cebadores ApMSP2F y ApMSP2R, y una sonda ApMSP2P [ 54 ] ( Tabla 1 ).
Tabla 1.
Cebadores y sondas específicos utilizados para la detección de Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum .
| Especies | Cebador/Sonda | Secuencia 5′–3′ | Concentraciones | Referencias |
|---|---|---|---|---|
| A. platys | EP-963F | CGCAGTTCGGCTGGATCT | 400 nm | [ 53 ] |
| EP-1029R | CCCAACATCTCACGACACGA | 400 nm | ||
| EP16Sp | FAM-TGACGACAGCCATGCAGCACCTG | 140 nm | ||
| A. phagocytophilum | ApMSP2F | ATGGAAGGTAGTGTTGGTTATGGTATT | 900 nm | [ 54 ] |
| ApMSP2R | TTGGTCTTGAAGCGCTCGTA | 900 nm | ||
| ApMSP2p | FAM-TGGTGCCAGGGTTGAGCTTGAGATTG | 125 nm |
La mezcla de reacción para A. platys consistió en 12,5 μL de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), 140 nM de sonda EP16Sp, 400 nM de cebadores EP-963F y EP-1029R, 5 μL de ADN molde y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 μL. Para A. phagocytophilum , la mezcla incluyó 12,5 μL de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), 125 nM de sonda ApMSP2p, 900 nM de cebadores ApMSP2F y ApMSP2R, 5 μL de ADN molde y agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 μL. Se procesaron controles negativos (agua estéril) junto a las muestras. Se utilizó un control interno para indicar la existencia de ADN genómico y la ausencia de inhibidores de PCR.
La amplificación multiplex se realizó en un termociclador C1000™ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.), utilizando el sistema de detección en tiempo real CFX96™. Las condiciones térmicas consistieron en 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 62 °C durante 1 min. La señal fluorescente obtenida de los canales FAM y HEX se analizó con el software CFX Manager versión 3.1 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).
5. Conclusiones
Las pruebas serológicas ilustran la exposición a la infección, pero no una infección o enfermedad aguda precisa, mientras que las pruebas moleculares son muy específicas y sugieren una infección activa. Además, las muestras de sangre son muy sensibles para la detección por PCR de enfermedades transmitidas por vectores caninos.
La información de que los perros pertenecían al mismo hogar refuerza la idea de que la prevalencia de la anaplasmosis en el este de Rumania es elevada y está mal diagnosticada.
La anaplasmosis granulocítica canina se subestima en las clínicas veterinarias de Rumanía debido a la inespecificidad de sus signos clínicos, correlacionados con la diferente sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas inmunocromatográficas, así como con la posibilidad de confundir la mórula de A. phagocytophilum durante el análisis citológico de la sangre. Por lo tanto, se debe considerar la presencia de Anaplasma spp. en el diagnóstico diferencial; se recomienda evaluar la asociación de síntomas, patología y pruebas moleculares para un diagnóstico preciso, especialmente en donantes de sangre canina.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a Anca Maria Carter Timofte, de la Universidad de Liverpool, por corregir la versión revisada en inglés del manuscrito.
Contribuciones del autor
Conceptualización, G.-VM, LI y LM; metodología, LA, RM y GS; investigación, G.-VM, R.Ș. y SM; recursos—LI, LA, RM y SM; redacción—preparación del borrador original, G.-VM y LI; supervisión, LM Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Declaración de la Junta de Revisión Institucional
No aplicable
Declaración de consentimiento informado
Se obtuvo el consentimiento informado del propietario para la publicación de este informe de caso.
Declaración de disponibilidad de datos
Los datos están contenidos en el artículo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Declaración de financiación
Esta investigación no recibió financiación externa.
Notas al pie
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